IAC-HPLC熒光檢測法測定飼料中的玉米赤霉烯酮方法研究

 

Determination of zearalenone in feed—high performance liquid chromatigraphic method with immunoaffinity column clean-up

 

摘  要：飼料樣品經乙腈-水（8+2）提取，提取液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，經免疫親和柱凈化后，凈化提取液用反相高效液相色譜熒光檢測器測定，可以準確檢測飼料中玉米赤霉烯酮含量。IAC-HPLC熒光檢測法可以有效地將玉米赤霉烯酮與其類似物區別開。利用配合飼料、預混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米進行玉米赤霉烯酮回收率實驗，回收率在90.1%-118%之間。利用魚粉、預混料、雞配合飼料、玉米進行方法穩定性試驗，室內相對標準偏差均在5%以內。因此，本方法中建立的免疫親和柱凈化、高效液相色譜熒光檢測法具有良好的準確性、穩定性和特異性。

關鍵詞：玉米赤霉烯酮 免疫親和柱 高效液相色譜 飼料

Abstract: A method was developed for the determination ZEN toxin in feed by liquid chromatography with fluorescence detection after immunoaffinity column clean-up. ZEN was extracted with acetonitrile-water(80:20 V/V), and diluted with phosphate buffer solution. ZEN was differentiated from its analogue with this method. Recoveries from the different feed spiked with ZEN were from 90.1%-118%, with relative standard deviation of less than 5%. This method was accurate, reliable and sensitive.

Key words:Zearalenone;Immunoaffinity column; high performance liquid chromatography; feed

 

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種具強烈致畸作用的生殖系統霉菌毒素，我國飼料衛生標準^[1]中規定了配合飼料和玉米的允許量≤0.5mg/kg，但我國現有的ZEN檢測標準^[2]中使用的薄層色譜法為半定量法、酶聯免疫吸附法為篩選法，兩種方法都不是準確定量法，因此，建立準確高效的檢測方法對于檢測和控制飼料中玉米赤霉烯酮含量具有重要意義。

免疫親和柱（IAC）由于其高選擇性、高靈敏度、凈化效果好、易操作的特點而被普遍用于霉菌毒素的檢測。國際標準ISO 17372:2008^[3]采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法對飼料中玉米赤霉烯酮進行檢測，類似技術路線在檢測大豆、油菜籽、植物油等中的玉米赤霉烯酮時也廣泛使用^{[4, 5, 6]}。本研究旨在建立飼料中玉米赤霉烯酮的IAC-HPLC熒光檢測法。

1 試驗研究

1.1 儀器

振蕩器；氮吹儀；高速均質器；高效液相色譜儀（配有熒光檢測器）；色譜柱：C18 柱，長150 mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm；真空裝置或空氣壓力泵；玻璃微纖維濾紙（直徑11 cm、孔徑1.5 μm）；試驗篩（1 mm孔徑）。

 

1.2 試劑及材料

玉米赤霉烯酮免疫親和柱（容量≥2 μg）；乙腈；甲醇；氫氧化鈉溶液：c（NaOH）=0.2 mol/L；玉米赤霉烯酮標準品，玉米赤霉烯酮含量≥99.5%；提取劑：乙腈+水（8+2）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：將8 g氯化鈉、1.16 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀溶解至1000 mL水中，用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.4；流動相：量取460 ml乙腈至1000 mL的容量瓶中，加入460 mL水和80 mL甲醇?；旌暇鶆虿⑼ㄟ^0.45 μm濾膜，備用。

1.3 標準溶液的配制

玉米赤霉烯酮標準工作液：用流動相分別配制濃度為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.0 μg/mL的標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1提取

稱取試樣40.0 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入4.0 g氯化鈉及100.0 mL提取劑，于振蕩器上振蕩60 min，或于高速勻質器勻質2min后，用定量濾紙過濾，準確移取10 .0mL濾液并加入40.0 mL PBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。

1.4.2凈化

   將免疫親和柱連接于10.0 mL玻璃注射器下。準確移取10.0 mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，抽干。分別以10.0 mL純水淋洗柱子兩次并抽干。準確加入1.5 mL甲醇洗脫，流速不大于2 mL/min，收集洗脫液于55℃氮氣吹干，用1.0 mL流動相溶解殘渣，渦旋混勻，過0.45 μm濾膜，上機測定。

1.4.3測定

色譜測定流速：0.8 mL/min；檢測波長：激發波長274 nm；發射波長440 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。分別取相同體積樣液和標準溶液注入高效液相色譜儀，在同等色譜條件下測定試樣的響應值（峰高或峰面積），經過與玉米赤霉烯酮標準溶液譜圖比較響應值得到試樣中玉米赤霉烯酮的濃度。

 

2 結果與討論

2.1 干擾性試驗

玉米赤霉烯酮類有六種類似物分別為玉米赤霉烯酮（ZON）、玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL）、玉米赤霉酮（ZAN）。

圖1 紫外法檢測六種玉米赤霉烯酮類圖譜

該六種物質可以應用于HPLC紫外法檢測，經過玉米赤霉烯酮免疫親和柱凈化后，六種物質回收率都大于80%，見圖1。

六種物質中，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇三種可以用熒光檢測器檢測。該三種物質應用玉米赤霉烯酮IAC凈化后，從圖2中可以看出，IAC-HPLC熒光檢測法可以很好地將三種物質分開。

圖2 熒光法檢測三種玉米赤霉烯酮類似物圖譜

 

2.2標準曲線與線性范圍

配制ZEN標準液濃度分別為5、20、50、200、500μg/mL，按上述實驗條件進樣，以所得峰面積A對濃度（μg/mL）進行回歸分析，結果表明線性關系良好（見圖3）?；貧w方程為y=1848.6x-4843，相關系數為0.9999。

圖3 玉米赤霉烯酮標準工作曲線

2.3 準確度與精密度試驗

分別選擇配合飼料、預混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米不同產品進行回收率試驗?？瞻讟悠愤x擇不含有玉米赤霉烯酮或含量較低的樣品（含有玉米赤霉烯酮的需扣除空白，見圖4）。樣品中添加不同濃度的標準溶液，充分搖勻，使標準溶液與樣品充分吸收，按照本實驗方法進行測定，其回收率見表一。

表一 飼料中玉米赤霉烯酮添加的回收率試驗

樣品種類	添加濃度(μg/kg)	檢測濃度（μg/kg）	回收率%
水產配合飼料	50	53	106
	500	569	114
豬濃縮飼料	500	491	98.2
豬預混料	500	515	103
魚    粉	50	59	118
	500	488	97.6
豆    粕	100	99	99
豬濃縮飼料	150	157	105
豬預混合飼料	200	200	100
豆粕	200	208	104
雞配合飼料	500	504	101
玉米	10	9.38	93.8
	100	93.7	93.7
	500	472	94.3
豬配合飼料	10	9.06	90.6
	100	90.7	90.7
	500	482	96.5
魚粉	100	90.3	90.3
預混料	100	90.1	90.1
濃縮料	100	93.1	93.1

上述不同樣品，添加濃度分別為10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、500μg/kg的情況下，回收率在90.1%-118%之間，平均回收率為98.9%?；厥招Ч^好。

利用魚粉、預混料、雞配合飼料、玉米進行添加試驗。樣品中添加不同濃度的標準溶液，充分搖勻，使標準溶液與樣品充分吸收，每個添加水平重復測定7-9次，按照本實驗方法進行測定，其回收率相對偏差見表二。

表二 飼料中玉米赤霉烯酮添加的回收率試驗

（%）

樣品	魚粉		預混料		雞配合飼料		玉米
濃度 （μg/kg）	50	200	50	200	50	200	10	100	500	1000
1	91.1	96.5	86.9	86	93.7	94.3	100.4	102.3	87.59	81.19
2	93.4	94.8	88.8	90.7	95.4	94.1	98.77	101.1	90.92	81.19
3	93.7	95.7	90.3	89.6	93.5	94.4	99.15	100.9	92.01	80.31
4	94.1	97.3	89.3	84.7	96.8	93.5	99.48	101.5	90.83	80.61
5	95.4	93.9	87.3	91.5	95.2	91.5	100.5	101.3	85.3	80.73
6	95.5	94.9	91.2	91.3	97	89.1	97.98	102.2	85.93	80.98
7	96.7	95.2	85.3	89.1	96.5	94.4	99.55	101.7	93.25	80.46
8	97.6	—	92.2	—	95.8	—	99.32	101.5	85.5	80.71
9	97.5	—	91.7	—	95.2	—	95.99	101.3	86.07	80.53
平均（%）	95.0	95.5	89.2	89.0	95.5	93.0	99.02	101.5	88.6	80.7
C.V（%）	2.3	1.2	2.7	3	1.3	2.2	1.39	0.462	3.54	0.39

從表中數據可以看出，在本方法規定的條件下，回收率數據在80.3%～102.3%之間，平均回收率92.70%，室內相對標準偏差均在5%以內。

圖4 玉米、魚粉、雞配合飼料空白樣品及部分添加樣品的對照色譜圖

 

3  結論

玉米赤霉烯酮六種類似物中只有玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇可以用熒光檢測器檢測出來，通過圖譜可以看出，此方法能較好地將這三種物質區分。本試驗利用配合飼料、預混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米進行玉米赤霉烯酮回收率實驗，添加濃度分別為10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、500μg/kg，回收率在90.1%-118%之間，平均回收率為98.9%。利用魚粉、預混料、雞配合飼料、玉米進行方法穩定性試驗，室內相對標準偏差均在5%以內。因此，本方法中建立的免疫親和柱凈化—熒光檢測器的高效液相色譜法具有良好的特異性、準確性和穩定性。

中心實驗室 發布時間:  2017/8/15 13:16:00 瀏覽量:  967