利用免疫親和層析-熒光光度法測定飼料中的黃曲霉毒素B₁

 

摘  要：利用免疫親和層析-熒光光度法對飼料中的黃曲霉毒素B₁進行測定，測得其相關系數為0.9899，平均回收率為97.66%，各重復之間的變異系數均小于15%，陽性可用HPLC法進行確認，具有高效、快速、準確、安全等特點。

關鍵詞：黃曲霉毒素B₁，免疫親和層析，熒光光度法，飼料

 

黃曲霉毒素B₁是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。前者為基本毒性結構，后者與致癌有關。黃曲霉毒素B₁是已知各種真菌毒素中最穩定的一種。結晶的AFB₁在高溫（200℃）及紫外照射下都不被破壞。在所有真菌毒素中，黃曲霉毒素B₁的毒性、致癌性、污染頻率均居首位。因此，研究黃曲霉毒素B₁快速準確的檢測方法具有十分重要的社會和經濟效益。

    在我國，飼料中黃曲霉毒素B₁常用的檢測方法有薄層色譜法（TLC）和酶聯免疫吸附法（ELISA），而對飼料中黃曲霉毒素B₁的免疫親和柱-熒光分光光度法研究得較少。免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉單克隆抗體固化在水不溶性的載體上，然后裝柱而成。黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光分光光度法是以單克隆免疫親和柱為分離手段，用熒光計、紫外燈作為檢測工具的快速分析方法。它克服困難TLC法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物和在樣品預處理過程中使用多種有毒、異味的有機溶劑，毒害操作人員和污染環境的缺點。用檢測黃曲霉毒素B的方法將黃曲霉毒素B₁、B₂分離出，用高效液相色譜（HPLC）方法測定B₁的含量。本文中對利用免疫層析法-熒光光度法檢測飼料中黃曲霉毒素B₁的方法性能進行研究。

 

1 材料與方法

1.1 試劑和溶液

1.1.1 甲醇：色譜純。

1.1.2 甲醇+水（8+2）。

1.1.3 氯化鈉。

1.1.4 PBS緩沖溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節pH值到7.0，最后用純水稀釋至1000mL。

1.1.5 吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000mL。

1.1.6 pH7.0磷酸鹽緩沖溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氫鉀溶液與29.1mL 0.1mol/L的氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100mL。

1.1.7顯色液。

1.1.8 豬配合飼料。

1.2 儀器設備

1.2.1 黃曲霉毒素B系統免疫親和柱（北京中檢維康提供）。

1.2.2 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

1.2.3 玻璃試管：直徑12mm，長75mm，無熒光特性。

1.2.4 熒光分析儀。

1.2.5高速均質器：18000r/min~22000r/min。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗準備

1.3.1.1 標定熒光計。

1.3.1.2 每天配制AflaTest顯色液。

1.3.1.3 配制甲醇/水（80：20 體積比）溶液（每周或按需要）。

1.3.1.4 試劑空白試驗（1mL 甲醇+ 1 mL 顯色液置于試管中），熒光計讀數應為。

1.3.1.5 空白試驗（2mL純水置于測試管中），熒光計讀數應為0。

1.3.2 樣品提取

1.3.2.1 稱取50g磨細的樣品，5克NaCl，置于攪拌杯中。

1.3.2.2 加入100 mL甲醇/水（80:20）溶液。

1.3.2.3 蓋上攪拌杯的蓋子，高速攪拌1分鐘。

1.3.2.4 取下蓋子，將提取物通過折疊式濾紙過濾，濾液收集于干凈的容器中。

1.3.3 提取物的稀釋

1.3.3.1 移取10 mL上步的濾液，置于干凈的容器中。

1.3.3.2 用40 mL純水將濾液稀釋，混勻。

1.3.3.3 將上步稀釋液通過微纖維濾紙過濾，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL。

1.3.4 分離柱色譜操作

1.3.4.1 將上步10mL濾液,以1-2滴/秒的流速全部通過Afla B親和柱,直至空氣進入到親和柱中。

1.3.4.2 將10 mL真菌毒素清洗緩沖液以1-2滴/秒的流速通過親和柱。

1.3.4.3 將10 mL純水以1-2滴/秒的流速通過親和柱，直至空氣進入到親和柱中。

1.3.4.4 用1.5 mL Afla B淋洗液以約1 滴/秒的流速淋洗親和柱，將所有樣品洗脫液（1.5 mL）收集于玻璃測試管中。

1.3.4.5混勻后，立即將測試管置于已標定好了的熒光計中。60秒后，讀數。

1.3.5 往飼料進行添加，分別做線性試驗、回收率及重復性實驗。

2 結果與分析

2.1 線性（豬配合飼料）

       相關系數為0.9899。

 

2.2 回收率

表1 黃曲霉毒素B₁回收率試驗

添加濃度(ppb)	1.6	3.2	6.4	8.0
實測濃度(ppb)	1.52	2.92	7.12	7.45
回收率（%）	95.00	91.25	111.25	93.12

平均回收率為97.66%，各重復之間變異系數均小于15%。

 

2.3 確認試驗

       利用高效液相色譜法可以進行確認和準確定量。

圖2 黃曲霉毒素B系列的標準圖譜

 

3 結論與討論

傳統的薄層層析法在檢測黃曲霉毒素B₁時，具有以下缺點：

⑴為滿足黃曲霉毒素B₁檢測過程對層析柱設備和洗脫流速的要求，一個人一批最多只能做3~4個樣品，不能滿足大批量樣品的檢測任務。

⑵檢測中需要大量和多種的有機溶劑，如三氯甲烷、乙醚、甲醇、乙腈、正已烷等。在檢測大批量的樣品（如國家抽查樣品）時，需要使用大量的有機溶劑，對檢測、廢液回收等都帶來較大困難。

⑶由于黃曲霉毒素B₁本身具有劇毒，而在檢測過程中又需要使用大量溶劑，定性時需要使用三氟乙酸、消毒時需要使用次氯酸鈉等有毒或刺激性物質，若在進行大批量的檢測時，即使通風條件良好，檢測人員戴上口罩和手套，仍會感到喉嚨干燥，眼睛刺痛。因此不利于檢測人員的健康和安全。

⑷點板操作起來比較困難，不同的重復、不同的檢測人員之間均會有一定的差異。

⑸檢測結果與硅膠板的層度、均勻度有很大關系，也會給結果帶來不穩定性。

⑹定量檢測時需完全憑借檢測人員的眼力來目測，較難得出準確的結果，而且不同的檢測人員之間也可能得出不同的結果。

ELISA法往往對大批量的樣品使用較方便，若檢測樣品量較少時，則反而麻煩，價格也較貴，而且陽性結果也必須經過鑒定。

總之，免疫層析親和-熒光光度法既可適合大批量樣品檢測，也適合小批量樣品的檢測，而且具有快速、準確、安全的優點。

中心實驗室 發布時間:  2017/8/15 13:08:00 瀏覽量:  889